台湾清华大学胡育诚等改造维斯念珠菌高产十二烷二酸

国立清华大学胡育诚等人通过开发基于CRISPR的理性基因组和代谢工程方法，成功改造维斯念珠菌，使其高产十二烷二酸（DDA），最终构建的稳定菌株产DDA达224g/L，转化率为83%，生产强度为1.87g/L/h。研究背景与挑战维斯念珠菌是生产DDA等长链二羧酸的潜力菌株，但代谢工程改造困难，主要因缺乏合成生物学工具包。传统方法难以实现多基因共整合，且纯合整合效率低，限制了DDA产量提升。关键技术突破CRISPR系统优化开发基于PTDH1（II型启动子）的sgRNA加工体系，通过核酶顺式切割（如tRNAAla-HDV组合）释放成熟sgRNA。设计筛选标记（NrsR）分裂的CRISPR系统，将多基因一步整合到二倍体基因组中：第一盒：含SpCas9、sgRNA、CYP52A19（细胞色素P450单加氧酶）、CPRb（NADPH-细胞色素还原酶）、左侧同源臂及NrsR的3’端（r-NrsR）。第二盒：含FAO2（长链醇氧化酶）、右侧同源臂及NrsR的5’端（l-NrsR）。共同电转后，r-NrsR与l-NrsR通过400bp共享序列重组，形成完整NrsR标记，实现CRISPR介导的共整合。若仅单盒整合，细胞因标记不完整无法在诺尔斯菌素（Nrs）选择压力下存活。纯合整合效率提升调整HRL和HRR同源臂长度，优化基因编辑效率。针对Ade2基因（参与腺嘌呤合成）的杂合状态（Ade2+/-）导致选择压力不足的问题，采用2X YPD培养基复苏电穿孔细胞，4小时后加入25mg/L Nrs持续24小时，再将细胞划线至选择板，使纯合整合效率提升至60%。代谢通路强化关键酶共表达CYP52A19、CPRb和FAO2共表达，催化DDA生物合成中的不同步骤，消除中间体积累，显著增强DDA产量。额外共表达POS5（NADH激酶），提升NADH供应，进一步促进DDA合成并增强细胞生长。质粒整合策略因含CYP52A19和CPRb的质粒过大（≈18.9 kb），直接克隆FAO2困难，故采用分裂CRISPR系统实现四基因（CYP52A19、CPRb、FAO2、POS5，共13.6 kb）共整合。生产性能最终构建的稳定菌株在摇瓶发酵中产DDA 224g/L，转化率83%，生产强度1.87g/L/h，达到工业级生产水平。研究意义首次在维斯念珠菌中建立高效的CRISPR基因组编辑平台，解决了多基因共整合难题。为长链二羧酸（如DDA）的生物合成提供了可扩展的代谢工程策略，推动非模式微生物在工业生物技术中的应用。